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hiv病毒检测

时间:2019-02-10 12:15 来源:艾滋病检测试纸 作者:HIV试纸 点击:

hiv病毒检测感染的方法:作为HIV感染筛查实验,抗HIV ELISA更强调灵敏度测定的特异性和灵敏度;因为有人进行抗HIV验证测试以验证HIV ELISA的阳性结果,以及两次抗HIV测试,如果有错过的测试,可能会发生潜在的严重后果。

hiv病毒检测指标主要包括抗HIV,P24抗原和HIV RNA。特异性抗体和抗原的检测方法主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA),明胶颗粒凝集试验(PA)和免疫。渗滤色谱法(胶体金或硒试纸),免疫荧光试验,化学发光免疫试验和蛋白质印迹(WB)。 ELISA,PA,免疫过滤色谱和化学发光免疫测定都是初步筛选试验。

hiv病毒检测

WB是HIV抗体的确认测试。 HIV RNA的检测方法主要包括实时荧光逆转录(RT) - 聚合酶链反应(PCR),基于核酸序列的扩增试验(NASBA)和分支DNA(bDNA)。当抗HIV和P24抗原免疫测定为阳性时,HIV RNA测试也可用作确认测试。

一、hiv病毒检测之感染后外周血循环中特异性抗原,抗体和核酸的出现

HIV是双链RNA病毒,病毒的外膜是来自宿主细胞的磷脂双层,其中嵌入了病毒的gp120和gp41蛋白。 Gp120位于病毒表面,gp41是跨膜蛋白,gp120以非共价形式与gp41结合。病毒衣壳主要由p24蛋白组成。

由于发现艾滋病的原因是艾滋病病毒,在20世纪80年代中期,需要进行快速HIV-1感染筛查试验,主要有两个目的:(1)为献血者血液提供快速,可靠和廉价的筛查。降低输血感染艾滋病毒风险的手段; (2)提供一种敏感的HIV感染诊断方法。用于常规检测献血者的第一代ELISA试剂盒于1985年3月出现。受感染个体的大量血清学试验表明,抗HIV抗体所针对的主要抗原基本相同,尽管其特异性和相对水平相同。

个体抗体的不同从感染到感染。有许多由HIV编码的结构和调节蛋白,但有三种主要类型的抗体刺激机体产生抗体并出现在血液循环中:(1)膜(ewu)蛋白:前体膜糖蛋白gp160及其两个主要亚基,gp120和gp140; (2)聚合酶(pol)蛋白:逆转录酶p66和内切核酸酶p31; (3)核心(gag)蛋白质:前体蛋白质p55及其组分p24,p18和p15。

身体感染HIV后,血液中最早可检测的病毒是病毒RNA,感染后平均可在5到9天内检测到。 P24抗原可在约16天内检测到,约22天当天出现可检测的抗体。 p24和病毒表面蛋白(尤其是gp160和gp41)是体内第一种HIV抗体。在感染的早期阶段,即在抗体出现之前,外周血循环中病毒核酸的含量最高,可以达到10 ^ 6IU / ml或更高。抗体出现后,HIV RNA水平降低,通常为10 ^ 4IU / ml。

二、hiv病毒检测感染的方法

作为HIV感染筛查实验,抗HIV ELISA更强调灵敏度测定的特异性和灵敏度。因为有人进行抗HIV验证测试以验证HIV ELISA的阳性结果,以及两次抗HIV测试,如果有错过的测试,可能会发生潜在的严重后果,例如血站筛查献血者。

ELISA测定法是用于HIV抗体测试的最常用的筛选测定法,其已经历从第一代到第四代的开发过程。第一代抗HIV ELISA试剂盒是使用体外培养的HIV裂解物作为抗原建立的间接抗体试验,但在各种商业试剂盒中,病毒裂解物中含有的每种主要HIV结构表达的蛋白质可能有显着差异,尽管它通常包括包膜糖蛋白(即gp120及其前体gp160)和gag衍生物(尤其是p24和p17抗原)。

通过间接ELISA测定法测量的抗HIV抗体应该是抗HIV IgG,因为酶标记的第二抗体抗人IgG决定了这一点。使用HIV裂解物作为包被抗原的ELISA方法产生的假阳性主要是由于某些患者血清中污染物与某些常见HLA抗原(特别是HLA-DR和其他II类抗原)的结合,其他例如,之前血清失活该试验,慢性血液透析患者,急性疟疾,黄粉虫感染患者,系统性红斑狼疮等也可引起假阳性。

第二代抗HIV检测试剂与第一代不同之处在于它们使用基因工程重组抗原或合成肽代替培养病毒抗原,并且测定模式仍然是间接方法。由于应用重组抗原,避免了由HLA抗原引起的假阳性结果。

第三代试剂和第二代试剂之间的差异主要在于测量模式,其使用双抗原夹心法代替间接法。通过双抗原夹心法测量的抗HIV不仅是IgG,而且还有IgM,IgA等,并且由于样本中的非特异性IgG,不需要担心大量的样本。由于干扰而发生假阳性结果,因为与间接方法相比,双抗原夹心的样品量可以大大增加。因此,与第二代试剂相比,第三代试剂的灵敏度大大提高。目前,国内抗HIV ELISA试剂盒也是双抗原夹心法。

使用双抗原夹心一步检测抗HIV需要注意由“钩效应”引起的假阴性问题。一些HIV感染的患者具有高抗体滴度。可以使用具有双抗原夹心的一步检测,并且可以发生类似于用于检测抗原的双抗体夹心一步法的“钩效应”现象。因此,为了避免由于“钩子效应”引起的假阴性,国内试剂盒在筛选血站的献血者时是两步法。

因此,为了提高抗HIV ELISA测定的灵敏度和特异性,将重组HIV抗原用作包被抗原而不是病毒裂解物。重组HIV抗原不仅高度纯化,而且易于大量获得,并且还可以很好地控制涂层。浓度与不同组分的量的比例。然而,缺点是重组抗原可能在表位上具有损失,并且由于糖基化的一些差异可能与天然蛋白质不同。

所谓的第四代抗HIV检测ELISA试剂盒是抗体和P24抗原的组合检测试剂。献血者的血液筛查可缩短测试窗口。
Western印迹(WB)测试是抗HIV确认测试,其中在切割培养的HIV后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗原组分,然后转移到硝酸纤维素膜上。当检测到抗体时,将血清样品加入到硝酸纤维素膜中,孵育后,样品中的特异性抗体可以与膜上相应的抗原结合,洗涤后,酶标记的抗人IgG抗体加入,孵育和洗涤后,加入底物使其显色。

Western Blot检测结果的判断可以按照以下原则进行[中国疾病预防控制中心,国家艾滋病检测技术规范(2009年修订)],如果:1不能判断为阴性出现在整部电影中。任何颜色发展的乐队; 2没有对应于已知分子量病毒蛋白的条带。在蛋白质印迹试验中,与已知分子量HIV抗原无关的条带出现在普通膜上,并且这些条带的外观通常与HIV抗原混合以与HIV相关。抗体由交叉反应的蛋白质产生。

对于由不同制造商生产的套件或同一制造商的不同批次,这种交叉反应带的外观是不同的。 Western Blot检测的阳性标准为:1抗-P24,抗-gp41和抗-gp160 / 120条带中至少有2个阳性;该标准基于国家和地区公共卫生实验室主任协会成立于1988年,并于1989年被美国疾病控制中心(CDC)采用; 2是根据特定试剂盒提供的阳性判断标准,并且不能判断为阴性或阳性的Western印迹结果可以确定为“不确定”。其主要特征是膜上的反应带与已知的HIV蛋白或其他未知蛋白(可能是非病毒蛋白)相关,最常见的是单独的抗P24带阳性和/或抗P55带阳性。

大多数其他经常发生的非特异性反应条带可能是由于病毒裂解物中的交叉反应性HLA I类和II类抗原。使用重组HIV抗原代替病毒培养物裂解物制备蛋白质印迹硝酸纤维素膜。抗原条带无疑会大大减少这种“不确定”结果的出现。 “不确定”的结果如果有临床症状或高风险HIV暴露的患者应该按原样(如果可能的话)进行重新检测,如果仍然“不确定”,可以确定病毒核酸,或者持续数月。在测试中,如果仍然没有明确的阳性,基本上可以排除艾滋病毒感染的可能性。

Western Blot不适合HIV抗体筛查试验的原因主要是因为这种“不确定”结果的频率太高。研究表明,通过ELISA和PCR方法阴性的同性恋或双性恋患者中20%至30%的血清可以使用Western Blot检测一个或多个条带,并且超过一年。在随访检查中,70%的抗HIV ELISA,HIV RNA RT-PCR阴性和Western Blot可疑同性恋患者在进行Western Blot时显示一个或多个条带。对于低风险群体的研究也是如此。因此,Western Blot仅适用于ELISA或其他抗HIV筛查测试的确认测试。

实时荧光RT-PCR目前用于中国的HIV RNA检测。方法。疾病预防控制中心和一些国内传染病医院在检测艾滋病毒负荷时使用进口的bDNA试剂。病毒载量的临床检测旨在监测抗病毒治疗的有效性。血液供体献血者的血液筛查是定性测试,并且实时荧光RT-PCR和转录介导的扩增(TMA)方法目前在国内外使用。迄今为止,病毒核酸检测是最小化检测窗口期的最有效方法。

三、hiv病毒检测感染的程序

目前,国际和国内HIV抗体筛选试剂的特异性和敏感性相对较高,但除上述疾病外,交叉反应抗原的存在可引起抗HIV ELISA试验的假阳性,具体检测该药物的阳性预测值也与特定感染人群的患病率有关。假设抗HIV ELISA试剂盒的灵敏度和特异性均为99.9%。如果HIV感染率为1.0%,阳性预测值为91%,假阳性率低于10%,如果患病率为0.04%,阳性预测值为28.4%,误报率为大于71%。研究表明,中国献血者第三代试剂筛查阳性率为0.2%(2439 / 1,195,286),阳性率为0.0009%(11/1,195,286)。因此,如果计算出0.0009%献血者中HIV感染的患病率,则假阳性率大于99%。因此,必须确认所有对筛选试验呈阳性的样本。

四、hiv病毒检测感染的报告结果解释

使用商业ELISA试剂盒在感染后几个月内对HIV感染的患者进行阳性检测,结果应为阳性,因为这些试剂盒中使用的包被抗原主要是gag编码的蛋白质和病毒包膜蛋白。蛋白质的抗体首先出现在HIV感染的免疫应答中,并且ELISA的灵敏度足以早期检测到它。因此,如果怀疑HIV感染,但ELISA检测结果为阴性,则HIV感染的可能性非常小。

通常,除非实验程序或试剂有问题或者可能无法确定感染的确切日期,否则如果HIV抗体ELISA测定是阴性的,则不必立即重复测试。对于处于正判断值(截止)边缘的样本,即略低于截止值,很难确定它是早期感染还是非感染者的样本。此时,可以再次采集血液和/或测试另一种ELISA试剂盒以确认结果。

在这种情况下,如果测定结果仍处于截止边缘,建议在几个月后再次测量。如果仍然没有变化,则表示没有感染艾滋病毒。在这种情况下,其他HIV RNA测定例如免疫印迹和PCR测定也是HIV感染验证测定。

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